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今日（6月23日）晚，金沙集团1991入口对外发布《向特定对象发行股票发行情况报告书》（下称《报告书》），确定公司向特定对象发行股票事项发行完毕。广州高新区投资集团获配股数最多，认购金额近9000万元。《报告书》显示，本次发行价为10.26元/股，发行股数3345.06万股，募集资金3.43亿元，发行对象为12家。其中广州高新区投资集团获配股数最多，认购金额近9000万元。金沙集团1991入口相关负责人表示，本次募集资金扣除发行费用后将用于合同研发生产组织（CDMO）平台建设项目、创新药研发服务平台建设项目、临床研究服务网络扩建与能力提升项目以及补充流动资金。
2021-06-23
本文为系列文章《大分子生物分析概论》的第九篇，旨在根据已发表的文献资料，介绍大分子生物分析中对关键试剂的管理。由于内容篇幅较长，本文将采取上下篇形式进行推送，敬请垂注！《袁来如此》专栏系广州金沙集团1991入口微信公众号打造的科普学术专栏，内容均为金沙集团1991入口子公司深圳博瑞副总经理袁智博士原创。1.导论配体结合式测试方法（ligand binding assays, LBA）广泛地用于测定生物药在动物和人体体液中的浓度，从而评估其药代动力学、免疫原性以及与疾病相关的生物标志物。是而这些测试方法的基础则是试剂，LBA方法的特异性、选择性和灵敏度都取决于这些试剂。受药物的应用、开发阶段、业务和资源的影响和限制，LBA试剂的多样性及其应用，演进出多样化的管理方法。例如，非临床毒理学（TK）和临床药代动力学（clinical PK）的分析任务可能类似；但对用于临床检测方法，随着新药项目通过临床开发的不同阶段，需要对试剂的多个批次变化及其长期存储的稳定性进行管理。虽然没有一个适合所有状况的应对方法，管理试剂生命周期的努力往往分为两类：（1）对大量使用的某一个批次的试剂，其存储稳定性和物流将是主要问题；（2）如果使用小批次，批次更改的管理将是主要问题。业内已然认识到，某些试剂至关重要，其变化会显著地改变或削弱使用它们的测试方法的性能。对关键试剂的控制是保证LBA测试方法的质量和效能长期一致的基础。尽管目前的监管指南为PK和免疫原性测试方法的验证提供了非常具体的指导，但一般没有就关键试剂的生命周期的许多方面提供足够的指导，包括试剂的稳定性。美国FDA和欧洲药品管理局（EMA）发布的生物分析方法的指南只是提供了一些与关键试剂相关的关注点。在日本，关于LBA的指南草案现已公开审议。巴西、中国和印度则没有任何相关指南。已发布的指导文件和白皮书对关键试剂的管理大多只是泛泛而谈，在如何管理不断变化的关键试剂方面缺乏通用的实际操作指南：包括重要和次要批次更改、文档记录、测试试剂的稳定性及其性能标准和批次间的连续性。因此，整个行业需要一个统一的方法，以提高一致性，并基于健全的科学和监管原则作出相关决策。经过研究有关LBA关键试剂的全球指南和文献，本文总结出如下共识和最佳做法供讨论和实施：根据经验和研究已发表的文献，试剂需要在测试方法的生命周期的背景下加以考虑和管理。特别是，对一个关键试剂的表征，对于最初选择该试剂和在该测试方法的整个生命周期内有效地供应这个关键试剂，非常重要。以下主要关注四个方面：• 关键试剂的记录文档• 内部关键试剂与商用试剂的异同• 关键试剂的更换• 关键试剂的稳定性。本文不打算考虑的议题包括参比试剂（reference standards）和内标（internal standards），基于细胞的PK测试方法和抗药物抗体（ADA）检测所需的样本基质以外的基质。总体而言，对于关键试剂管理存在着多种做法的结论，在某些领域形成了高度共识。值得一提的是，相关调查结果表明，有关文档记录的监管指南有不一致之处，特别是对于批次变更，只有约 50% 的法规指南具有解决批次变更的程序。大多数被调查者表示拥有关键试剂的生产程序，但没有过期后有效期再延长的程序。2.建议和最佳做法关键试剂的定义虽然在某些情况下，测试方法的任何组成成分对其性能都可能至关重要，但对任何特定测试方法的关键试剂都需要产生一个准确定义。难以生产、替换、获取或取代的试剂可被视为稀有关键试剂；相反，更通用的试剂，如抗轻链或重链抗体，在某些检测中也可能至关重要。免疫捕获与LC-MS结合的测试方法可能需要将捕获抗体视为关键试剂，即使是测试缓冲液或阻断试剂也可能对ADA检测的性能至关重要。如果需要将某个试剂定义为关键试剂，就需要主动地管理试剂的可及性和可重复性，应当通过制定书面的相关程序，用以定义某些试剂为关键试剂，并在整个测试方法的生命周期内管理这些试剂。虽然大多数监管机构尚未定义关键试剂，但确实讨论了LBA相关试剂的关键性质。2001年发布的FDA《生物分析方法验证的行业指南》中将一些试剂定义为重要和关键（key and critical），并概述了在测试方法的整个生命周期中管理这些试剂的各个方面，包括交叉反应性（cross-reactivity）、储存条件的定义、稳定性评估以及当批次改变时，评估抗体和标记了的被分析物（示踪剂，tracer）的性能，都表明了这些试剂的关键性质和是需要评估的。这些评估的需求可以很容易地扩展到其它的LBA试剂。2011年EMA生物分析方法验证指南支持并拓宽了2001年FDA指南中的关键/关键试剂的概念。这些指南认识到测试方法的特异性是由所使用的试剂决定的，对关键试剂的控制对于测试方法的质量和长期保持其效能是至关重要的，监管机构和一些文献都提出将某些试剂确定为关键试剂。本文建议定义以下关键试剂：对待测物（analyte）特异性的LBA分析试剂通常被视为关键试剂（抗体，多肽，蛋白质，耦合物（标记），作为试剂的药物和ADA试剂（阳性和阴性对照品）。EMA指南将关键试剂定义为"...结合试剂（binding reagents），例如，结合蛋白、aptamer、抗体或耦合后的抗体）和那些含有酶活性域，对测定结果有直接影响的试剂......"。生物分析界同意并扩大这一定义，以包括多肽，如受体或配体及它们的片段。监管指南非常明确地说明了，对于PK标准品（PK reference standards），需要如何作为标准品进行控制和评估。然而，PK标准品也可以成为一个关键的试剂，无论是在免疫原性还是靶标生物标志物的检测中（通常是在耦合后）。生物标志物的校准物（Biomarker calibrators）通常远不如药物标准品（drug reference standards）的表征充分。因此，批次变化更难于控制，而且往往得不到来自认可源头（例如，US Pharmacopeial Convention）的校准物。虽然生物标志物校准物不在本文讨论的范围内，但可以总结性地指出，关于生物标志物校准物的具体指南通常都缺乏，因而在预期做法与实际操作之间存在很大差距。3.关键实际的表征（Characterization）和认证（Qualification）关键试剂的质量是稳健地开发测试方法所必须的基本组成部分。测试试剂是根据它们对待测物（the analyte of interest）的特异性和样本基质以及其它试剂的交叉反应特性而开发和选择的。在方法开发之前和期间，可以通过多种方式测试这些试剂的特异性和交叉反应性。理解选择这些试剂的方式、原因以及性能，对于选择和认证新批次的试剂（如果需要的话）是非常重要的。临床和实验室标准研究所的指南强调需要对试剂进行表征，并提供了关键特性的指导。一旦测试方法开发完成并确定了关键试剂，就可以定义重新供应（resupply）关键试剂的风险。例如考虑复杂的免疫策略。对于商业来源的试剂，稀缺性（rarity）是主要挑战（例如，单一供应商/供货商，细胞株的可及性）；对于内部试剂，纯化和耦联的复杂性或是挑战可能。监管指南指出，关键试剂的表征和认证应针对预设的用途，但是所需要的试剂表征的程度，对给定的测试方法而言，差别可能很大。因此，本文不详描述试剂表征和初始认证的评估范围，而是仅仅建议：进行足够的表征，以便在生成新批次时，实现某种形式的一致性（consistency）和过程控制（process control），并且这种认证是有据可查的。试剂特征包括但不限于：身份(identity)、来源、纯度、浓度（或滴度）、结合亲和力（bindingaffinity）、等型（单克隆/多克隆抗体）、分子量、特异性（specificity）、成合比（incorporation ratio）和聚合程度(aggregation level)。若干文献详细讨论了关键的试剂表征和测试方法，药物开发的阶段也是投资试剂表征的程度和范围的考虑因素之一。4.关键试剂的采购考虑获得足够数量的关键试剂，无论是内部制备的，或是从商业来源采购的，最好是能够满足整个临床研究的需要。试剂可以在内部生产，也可以作为定制生产或现成的试剂从商业来源获得。然而，选择关键试剂的可靠来源，这个看起来显然很简单的任务，却并非易事。这可能需要仔细规划、考虑利弊以及进行尽职调查。内部生产试剂可获得内部定制生产的试剂，以适应所设计的测试方法; 可以对其预设的用途，进行大范围表征，可以自定义分析证书（CofA），产生稳定性数据等。更重要的是，可以监测和控制批次间的变异性（特别是在标记蛋白质时）。此外，对内部生产的试剂的管控，可能允许更好地进行生命周期管理。然而，内部生产试剂需要熟练的人员以及大量的投资，以建立一个试剂生产的基础设施和预先规划的生产过程。商业生产的试剂商用试剂广泛地用于各种格式的LBA的开发。商业试剂的主要优势包括：可以从多个供应商处立即获得各种试剂，通常对预设用途做过表征并附带有某种 CofA。此外，可以从多个来源获得各种检测试剂（标记过的蛋白），并在其中找到，对某个特定测定方法而言，性能卓越的检测试剂。除了现成的试剂外，许多供应商还提供定制生产和特定试剂的表征。这种方式的主要好处是：信誉良好的测试试剂的制造商通常拥有完善的生产设施，技术能力和知识储备，可以有效地支持试剂的生产和应用。此外，它们还可以为最终用户提供出色的支持，包括定制试剂的生成和耦合以及解决应用中出现的问题。然而，使用商业试剂并非没有挑战。有几个与商业试剂有关的问题，可能需要仔细考虑。其中一些列在表1中，包括缺少试剂的稳定性数据、缺少可用的试剂规格/批次放行的验收标准（尽管某些供应商可能会应客户的要求提供该标准）以及缺乏相关试剂的其他基本信息。最大的挑战是未标记和标记的试剂批次之间的变异性。在使用多个批次试剂的长期研究中，这可能会造成桥接数据的困难。生产商改变关键试剂的批次并不罕见，例如用于生产偶联体的多克隆抗体池，它们可能符合批次放行的规范，但可能对最终用户构成重大风险。此类变更很可能无法及时传达给最终用户。此外，特定试剂的生产可能会终止，并且不会提前通知客户。关于关键试剂采购的建议鉴于商业试剂来源于能力（雄厚的技术，支持性文件的实力，有提供多批次产品的能力）各不相同的多个供应商，谨慎的做法是进行尽职调查和可行性评估，以选择可靠的试剂和供应商。无论试剂是在内部生产还是从商业来源获取，了解试剂具体特征的需求都是一样的。与供应商建立密切关系是非常有益的，这有助于扩展技术支持的范围，以提高故障排除率，解决试剂相关问题，及时获取有关试剂批次变化的信息和确保特定批次的长期供应。此外，如果只有一家关键试剂的供应商，则建议考虑建立某种合同关系，这些合同关系可以给用户预警产品更改或生产停止。下面列出了值得考虑的若干的要点：& 来自不同供应商的相同浓度单位的重组蛋白和多肽在一个测试系统中可能有不同的表现。因此，选择并保留足够数量的试剂以满足长期需要是有益的。在某些情况下，如果已在验证期间确定一个校正因子，或者已生成能支持该校正因子的实验数据，则可考虑使用校正系数来补偿内容和比例错误（content and proportional errors）。& 供应商通常拥有质量控制/质量保证和批次放行的流程。尽管通常不能审核这些流程，但在某些情况下，可能有机会对供应商的设施进行QA审计。& 通常可以通过提出特定请求可以获得通常不伴随着试剂提供的文件（例如，与试剂的表征，稳定性，批次放行规范，等，相关的文件）。& 商业化生产的预涂层固相支持物件，如电化学发光和ELISA板材和珠子可能需要被视为关键试剂。应该建立和记录与这些关键试剂相关的内部流程，如批次验收测试，以确保板材的涂层均匀，尤其是在使用条带的情况下。对于使用商业试剂构建的内部生物标志物的检测方法，应使用含有内源性被分析物（endogenous analyte）的混合（pooled）生物基质（如血清/血浆）作为QCs，用来监测不同批次的商业试剂的性能。& 解释生产商的失效期数据，作为该试剂的测试/再测试的依据，因为该试剂在超过"到期日期"后，可能仍适用于预期用途。请参阅“试剂稳定性”部分，以得到相关的详细指导。表1.从内部和商业来源获得的试剂的有关注意事项5.关键试剂的更换用于配体结合测试方法的试剂通常由生物生产过程生产，而不是一个完全可控的合成过程。这将导致不同批次之间的可变性和异质性。蛋白生产出来之后，通常有纯化和标记步骤，这更增加了产品的复杂性。此外，通常需要在很长的一段时间里，使用这些测试方法，以支持一个药物的整个生命周期，这意味着可能需要多个批次的试剂来支持长期的测试。为了尽量减少批次之间的可变性，必须拥有规范良好，并且前后一致的试剂生产流程；也必须按照相关的生产方案和标记程序(labeling procedures)生产，并且完整地记录整个流程。但是，方案（protocols）和程序（procedures）的详细程度往往不合适（见最近的例子见15）。所以必须认识到：对生产程序的描述越详细，试剂生产的可重复性就越大，更换关键试剂可能是面临的最重大的挑战之一。在2001年生物分析方法验证指南中，FDA指出“...如果更改关键试剂，则可能需要重新优化或验证该测试方法”。此外，EMA指南规定，当试剂批次更改时，必须确认测试方法的分析效能，“以确保与原始批次或上一批次的试剂相比，该方法的效能不会改变”。对试剂的任何操作都代表该试剂成为一个新的批次（包括稀释）。OHara等人将试剂或某个批次试剂的更改归类为需要不同评估的级别：即主要和次要的更改。这样的评估是由科学驱动。建议事先确定一套明确的绩效评估方法和验收标准，并详细记录验收标准和相关实验。相关文件可以是指导试剂更改的标准操作程序（SOP），也可以作为最终方法报告的一部分。事实上，并非所有生物分析实验室都有相应的程序或者正式的SOP，用以管理试剂批次的变更。在某些情况下，认证可能只是使用新试剂批次的单个测试运行，或者在同一运行中使用新和旧试剂的单个测试运行。与旧批次比较是有用的，但不是绝对需要的，因为在许多情况下，旧（或原始）批次可能已经用完。某些实验室拥有定义更明确的、用于批次变更的测试方法验证程序。在某些情况下，对新试剂的定义也可能存在一些差异，例如从同一原始材料生产出来的新批次。业界最初认为，新批次试剂的认证和稳定性测试的接受标准应包括最大的仪器响应。然而，对基于仪器响应的信号控制图（signal control charts）的效用有不同意见。因此，需要关注下列事项：用于生成检测信号的分析平台；比较同一仪器随时间而获取的信号的能力；比较不同仪器的所产生的信号的能力以及环境温度等变量的影响。关于更换关键试剂的建议本文建议在一个功能性测试中测试新试剂，并采用预先验设立的检测验收标准。下面提出了认证这些关键试剂的两级式方法，测试的范围是由该试剂的变化程度，或者这些变化可能产生的影响程度所驱动的。在测试中，通常使用外加待测物的QCs来定义该方法的效能，但对于生物标志物的测定，可能需要包括含有内源性待测物（endogenousanalyte）的，基于真实样本的QCs，以确保commutability（可变性）。细微变化试剂的细微变化被定义为预期对测试性能影响极小的试剂改变；因此可以实施相关改变，而不会对数据生成产生任何有害影响。这种细微变化的例子是一个从以前认证过的原液发展而来新的试剂批次，如：从相同动物的多克隆血清做的新一次亲和纯化的产品；或使用相同批次的蛋白质做的新一次耦合反应，而该耦合过程已经被证明是受控良好的。用于制备新一个试剂批次的过程应与用于生成原始批次的过程相同。第一个测试级别包含所有试剂的资格认证计划中所共有的测试（图1）。& 推荐测试运行一次，包括3个级别的QC样品，但更理想的是包括定量下限和上限在内的，总共5个QC，因为定量范围的两个极端是PK和生物标志物测试方法最脆弱的地方。对于免疫原性测试，应包括3个级别的QC样品，包括接近切点的阴性和低阳性对照样品。& 如果同时更换多个试剂，则可以使用同一检测方法一起测试并认证这些试剂。建议执行多个测试运行，以提高对结果的信心，并且最大程度地降低接受假阳/阴性结果而导致的风险。但是，如果一次只更换一个试剂，则一次运行可能就足够了。& 建议在可能的情况下，并行地测试当前试剂与原始试剂。与原始批次的比较在监视或控制测定方法性能的漂移方面非常有用。但是，在没有可比较批次的情况下，对最大信号和/或 QC信号的监控就变得更加重要了。& 一旦从适当的认证测试生成了可接受的数据，其结果应作为能够接受试剂更换的记录，无需再做进一步认证。& 在结果不符合接受标准的情况下，可能需要进一步单独测试以确定失败的原因。单次失败可以通过重新制备一次标准样品和QCs，并重新测试来补救。然而，反复的失败至少会表明需要制备一个新试剂批次，并可能重新优化该测试方法。反复的失败也可能表明需要生产一批新的原始试剂；但这将被视为一个重大变更。& 建议监控QC样品的最大仪器响应，但仅仅作为判断测试方法性能的一个工具，而不是作为接受标准。随着在较长持续时间内或较大研究中收集，整理更多的数据，跟踪QC最大仪器响应趋势的价值会随之增加。重大变更这是最高的试剂认证级别，主要适用于在一个试剂的原始来源枯绝，需要更换关键试剂的情况。此时，将确定新的供应商，表征新的试剂，并证明新试剂的测试性能。重大变化的例子包括从新动物获得的抗体批次、用于单克隆抗体生产的新克隆，或用于生产重组物料的新细胞系。其中每个变更都预期需要广泛的重新认证。为了维持测试方法的性能，一个不太明显，但有时是必不可少的任务，可能是采用一个新批次的阴性对照品，这对于免疫原性测试的关系特别重大。除采纳对试剂细微变更时的认证建议外，对测试试剂的重大变更也应考虑采取以下行动（图1）：& 应至少执行三次测试运行，以表征新试剂的测试性能。& 在多次运行中，并行测试新试剂和原始试剂。如果新试剂不符合测试接受标准和/或其测试性能发生变化，但试剂仍然适合用于测试目的，则新试剂可能是可以接受的，但需要更广泛的认证，如部分方法验证。& 还需要其他数据来描述和正确记录新试剂对测试方法参数的全面影响。图1.关键试剂管理流程的总结 10.特别声明本文如有疏漏和误读相关指南和数据的地方，请读者评论和指正。所有引用的原始信息和资料均来自已经发表学术期刊, 官方网络报道, 等公开渠道, 不涉及任何保密信息。参考文献的选择考虑到多样化但也不可能完备。欢迎读者提供有价值的文献及其评估。参 考 文 献1. King, L, et al., Ligandbinding assay critical reagents and their stability: recommendations and bestpractices from the Global Bioanalysis Consortium Harmonization Team. The AAPSjournal, 2014. 16(3): p. 504-15.2. DeSilva B, et al. Recommendationsfor the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to supportpharmacokinetic assessments of macromolecules. Pharm Res. 2003;20(11):1885–900.3. Mire-Sluis AR, et al.Recommendations for the design and optimization of immunoassays used in thedetection of host antibodies against biotechnology products. J Immunol Methods.2004;289(1–2):1–16.4. Nowatzke W, Woolf E. Bestpractices during bioanalytical method validation for the characterization ofassay reagents and the evaluation of analyte stability in assay standards,quality controls, and study samples. AAPS J. 2007;9(2):E117–22.5. Rup B, O’Hara D. Criticalligand binding reagent preparation/selection: when specificity depends onreagents. AAPS J. 2007;9(1):E148–55.6. Staack RF, et al. Quality requirements for critical assayreagents used in bioanalysis of therapeutic proteins: what bioanalysts shouldknow about their reagents. Bioanalysis. 2011;3(5):523–34. doi:10.4155/bio.11.16.7.O’Hara DM, et al. Ligand binding assays in the 21st century laboratory:recommendations for characterization and supply of critical reagents. AAPS J.2012;14(2):316–28. doi:10.1208/s12248-012-9334-9.8.Miller WG, et al. Commutability limitations influence qualitycontrol results with different reagent lots. Clin Chem. 2011;57(1):76–83.9.Clinical LaboratoryStandards Institute (Formerly NCCLS). Assessing the quality of immunoassaysystems: radioimmunoassays and enzyme, fluorescence, and luminescenceimmunoassays; approved guideline. NCCLS I/LA23-A 2004;24 (16).10.Geist BJ, et al.Characterization of critical reagents in ligand-binding assays: enabling robustbioanalytical methods and lifecycle management. Bioanalysis. 2013;5(2):227–44.doi:10.4155/bio.12.304.11.Kirkwood TB. Predicting thestability of biological standards and products. Biometrics. 1977;33(4):736–42.12.Johnson RE. Commutabilitylimitations influence quality control results with different reagent lots. ClinChem. 2011;57(1):76–83.13.Myler HA, et al. Validationand life-cycle management of a quantitative ligand binding assay for themeasurement of Nulojix®, a CTLA-4–Fc fusion protein, in renaland liver transplant patients. Bioanalysis. 2012;4(10):1215–26.14.Wang W, et al. Antibodystructure, instability, and formulation. J Pharm Sci. 2007;96(1):1–26.15.Chang BS, Yeung B. Physicalstability of protein pharmaceuticals. In: Jameel F, Hershenson S, editors.Formulation and process development strategies for manufacturingbiopharmaceuticals. Hoboken: Wiley; 2010. p. 69–104.16.Krause PR. Goals ofstability evaluation throughout the vaccine life cycle. Biologicals.2009;37(6):369–78.17.Viswanathan et al.Workshop/conference report—quantitative bioanalytical methods validation andimplementation: best practices for chromatographic and ligand binding assays.AAPS J. 2007;9(1):E30–42.
2021-06-15
上周，“袁来如此”专栏初步介绍了LBA中的质量控制样品（QC，quality control）制备、认证（qualification）和批次一致性维护的相关概念和实践方法（袁来如此｜大分子生物分析概论（八_上）：LBA方法质量控制样品的制备和认证）。本期将延续上期内容，重点就监管机构对QC的要求、跟踪QC的效能趋势、防止分析漂移等方面做了详细解读。“袁来如此”专栏系广州金沙集团1991入口微信公众号打造的科普学术专栏，内容均为金沙集团1991入口子公司深圳博瑞副总经理袁智博士原创。监管机构对于QC的态度LBA测试中的QC样品，应通过在合格（qualified）的基质中加入已知浓度的参考（比）标准品（用于PK定量分析），或稀释/浓缩的含有阳性对照抗体的原液（用于ADA测试）来制备。关于QC样品的组成、目标值和接受标准的通用指南，已由下述监管机构发布：美国FDA，欧洲药监局(EMA)，日本卫生部，劳动和福利(MHLW)和巴西卫生监察局(ANVISA)。表3总结了监管机构对于定量（PK）分析中所使用的QCs的制备和组成的要求。表3.监管机构对用于定量分析QC的要求之比较。& 应按照确立的方法制备QCs。& 对于LBA定量方法，如PK分析，最少需要QC低、中、高三个浓度水平。高浓度QC的浓度大约是定量上限（ULOQ）的75%，中浓度QC的点相当于定量范围的几何中心（geometric center，定量下限和定量上限的中心点），低浓度QC是定量下限（LLOQ）的三倍或更低的浓度。QC浓度点应该包含在高浓度及低浓度校准点（calibrators）之间，否则即使满足%CV和%RE也不能接受。&对于LBA定性分析，如ADA测试，需要高浓度和低浓度阳性对照（HPC和LPC）；中浓度的QC通常包含在研究前验证中，但在真实样本分析过程中是可以不用的。相关指南文件中没有提供关于HPC外加浓度的具体要求。对于LPC的指导建议是，在所制备QC的浓度水平中，有大致1%的失败率。这意味着每100个LPC中有1个预计会落在筛选微孔板的切点之外。& 所有QC应当按照研究样本的预期存储条件和已验证的分析测试方法，以一次性使用的分装方式保存备用。不属于监管机构要求，但同样是良好做法的其它建议包括:& 制备足够数量的QC样品，以支持方法验证、短期和长期稳定性研究以及至少一项生物样本分析研究。& 可以制备大量的QC，以达到可使用数年的数量。如果已经进行了或正在进行的研究（能在报告研究样本的分析结果之前提供相关稳定性数据）表明稳定性评价覆盖了整个存储窗口期。跟踪QC的效能趋势2011年，美国FDA发布的《生产过程验证指南》介绍了制药过程生命周期管理的概念并建议：一旦建立和验证了每个过程的性能规范（performance specifications），就要对这些过程的质量进行监控。Sondag和Schofield建议也将检测/分析方法纳入生命周期管理，分析实验室负责制定分析趋势的内部指南。这些指导方针应预先确立，以防止研究过程中出现的问题。在理想情况下，趋势研究应在研究前验证时开始或者不迟于第一次生物样本分析。2018年FDA的生物分析指南已经解决了对QC样品性能的监控以及对任何漂移潜在原因的评估。尽管FDA没有提供如何进行监测的准则，但值得注意的是，FDA提供了用于CLIA的趋势跟踪方法，在某种程度上该方法也适用于LBA。因为CLIA要求多名分析人员，在多天内，多次运行不同的QC组合（QC sets）。QC趋势可以是实时的，也可以是间接的（Scherder和Giacoletti讨论了两种方法的区别），大多数SPC工具的设计目标是尽早发现QC的漂移（shifts），以便制定和实施适当的纠正措施。统计过程控制统计过程控制（Statistical Process Control，SPC）是一种评估QC趋势的方法论，用于确保一个系统按预期持续运行。SPC分析的两个主要目标是：(a)确认过程处于统计控制状态；(b)度量其产生符合特定规范结果的能力。SPC推荐以下步骤:1.使用初始QC数据（如n=30）计算平均值和标准差(SD)；2.使用平均值和标准偏差建立质量控制界限（QC limits）；3.建立所有其它QC规则（QC rules）；4.使用质量控制图表和建立的质量控制规则来监控过程中的趋势。如果一个过程或方法能够预测未来的结果，那么它就处于统计控制状态。这意味着必须理解该过程中的每一个变异性的来源。质量控制图表用于监控过程中的意外变化和漂移/位移(表现为系统性偏差)，控制图表有助于识别有害的分析测试事件，如果能够建立异常结果与方法参数改变（如不同的稀释剂批次、基质批次或分析人员）之间的相关性 。QC趋势分析中的控制图的主要类型包括QC的运行趋势图（run charts），Xbar-R图，组平均值的单个控制图（平均值的运行趋势图）。运行图表是绘制每个趋势测量的最简单的图。运行图表通常与显示一种测量值与另一种测量值之间差异的移动幅度图结合。Levey-Jennings(17)是LBA最常用的运行图表(图1)。另一种常见的控制图是Xbar-R图。这种图表类型演示了每组数据的平均值及其范围的趋势。图1. Levey-Jennings图示例。水平红线为下/上限值（lower/upper control limits，L/UCL）；虚线水平横线为观测平均值（μ0）。这些图表的控制限制是基于检测内的可变性建立的，这使得它们不太适合LBA QC趋势分析。图2是Xbar-R图的一个例子。此图还演示了这些图表类型是如何导致错误警报的。替代Xbar-R图表的是个体值控制图, 标绘的值是每个试验的平均值，这些是平均值运行图表。与Xbar-R图相比，平均值运行图的平均控制限度是基于试验间的变异性计算的。对于添加一个Xbar-R图表到平均值运行图上用于监控分析内变化趋势仍然是有用的。图2. Xbar-R图的示例。Xbar图表显示了每个实验的平均值；底部是R图，表示每个分析的观察范围。对于这两张图，水平的红线是下限值和上限值; 水平黑线虚线是实验中观察到的平均值。限于篇幅，相关图表就介绍到此，对所有细节感兴趣者请参阅文末的参考文献。防止分析漂移LBA的性能取决于其生物试剂组成的性能。这类分析方法严重依赖于蛋白质与蛋白质相互作用和分析试剂的结合特性，所有这些都影响分析组分对目标待测物的反应活性。随着时间的推移，这些因素使LBA容易发生校准偏移（calibration drift）。例如，蛋白质脱酰胺化或仅由一个糖基改变的糖基化模式就可能导致偏移。校准偏移的早期迹象包括但不限于校准曲线的斜率和渐近线的变化，分析中定量上限和下限的偏移，所有这些都可能导致样本浓度计算过低或过高。最终，校准偏移导致对药物动力学的错误描述。作为补充材料的一部分，提供了LBA校准偏移的常见原因列表。以下部分提供了预防方法偏移的评估和缓解策略。不管出于何种根本原因，以下参数均有助于识别效能偏移（performance drift）:标准曲线& 监测校准点浓度-响应关系，以确保校准曲线的响应值，特别是零和高浓度点的响应值，与研究前验证期间观察到的响应值相比，没有变化。这确保了LLOQ和ULOQ基本完整，其变异性（variability）与验证中所观察到的一致。& 确保校准曲线的斜率和渐近线与方法验证期间观察到的变异性一致。& 选择适当的替换校准品原液/参照品（reference standards），其效能特征与现有的校准品最相似。& 确保满足先前建立的等价条件（equivalence criteria）。& 关于校准曲线性能的其它建议，可以参考本文末DeSilva/Viswanathan/Azadeh等人的文章。质量控制样品& 根据之前建立的程序，交叉评估现有的和替换的QCs和/或校准曲线。加入阴性对照品和覆盖了测试范围的阳性对照品。& 追踪合格的QCs遗留批次和替换批次的测量值之间的百分比（%）差异。& 长期监控应包括上述遗留批次的百分比（%）差异的趋势 (或标称值，如果没有遗留批次)。& 建议包括稀释的QC。& 确保满足先前建立的等价条件（equivalence criteria）。金标准样品（gold standard samples，Proficiency Panel）金标准样品，例如美国药典（USP）或世卫组织标准（WHO）的标准品，可能只适用于临床实验室的检测，但如果可以获得时，可用于：& 同时评估金标准样本和QC样品，有助于识别校准曲线的漂移以及替换QCs的质量认证。& 如果金标准样品不存在,可以保留一组具有足够稳定性的研究样本，在未来替代QCs样品的质量认证中作为金标准。虽然控制图（control charts）是有效的监测工具，但它们仅利用从各自的校准曲线得出的QC样品的检测浓度。这意味着校准曲线和QC批次都是由相同的试剂制备的。交叉评估现有和替代QCs是正确的趋势分析和防止漂移的关键方法。在这方面，保留遗留的QC批次，并将它们与新QC批次桥接起来就显得颇为重要。因此，趋势研究和漂移监测最有效的方法就是交叉评估，即根据现有和替换的校准曲线来评估任何给定的QCs的效能。在保持可靠的趋势和检测漂移上，关键是下列问题：1. 一个适当的、合格的混合基质：经过验证的分析方法应明确认证替换混合基质的测试设计和接受标准。2. 适当的运行次数：有助于最大限度地降低可变性。3. 每次运行使用足够/适当数量的QC：大多数机构指南以及大量文献都提出了相关建议。4. 适当的位置可变性：将QC样品置于微孔板的左上和右下四分位点，或适当地放置在运行开始和结束的时候 (使用Lever-Jennings原则来监测QC的效能)。5. 在方法开发的早期和预研究验证中引入变化性的条件：不同的分析人员、不同时间段、多个微小规模的制备工作都是为了捕获变化因素。讨论成功地管理LBA方法的生命周期是通过证明质量控制样品（QCs）效能的一致性而实现的。由于QCs是关键的监控工具，所以实验室必须建立相关标准程序（SOPs），以制备、认证QCs并监测其效能趋势。本文旨在提供：1.与LBA的QCs相关的指南和最佳做法，同时在生物分析界建立共识；2.提出了更换QC批次的认证方法，并提供了监测QC效能的实用方法；3.讨论了管理和应对QCs样品的各种问题，可以作为生物分析实验室的参考文献。特别声明本文如有疏漏和误读相关指南和数据的地方，请读者评论和指正。所有引用的原始信息和资料均来自已经发表学术期刊、官方网络报道等公开渠道, 不涉及任何保密信息。参考文献的选择考虑到多样化但也不可能完备。欢迎读者提供有价值的文献及其评估。扩展阅读参 考 文 献1. Azadeh, M., et al., Quality Controls in Ligand Binding Assays: Recommendations and Best Practices for Preparation, Qualification, Maintenance of Lot to Lot Consistency, and Prevention of Assay Drift. The AAPS journal, 2019. 21(5): p. 89.2. DeSilva B, et al. Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules. AAPS J. 2003;20(11):1885–900.3. Viswanathan CT, et al. Quantitative bioanalytical methods validation and implementation: best practices for chromatographic and ligand binding assays. Pharm. Res. 2007;24(10):1962–73.4. US Food and Drug Administration. Guidance for industry: bioanalytical method validation. Silver Spring: Center for Drug Evaluation and Research; 2018.5. Azadeh M, et al. Calibration curves in quantitative ligand binding assays: recommendations and best practices for preparation, design, and editing of calibration curves. AAPS J. 2018;20:22.6. Nowatzke W, Woolf E. Best practices during bioanalytical method validation for the characterization of assay reagents and the evaluation of analyte stability in assay standards, quality controls, and study samples. AAPS J. 2007;9(2):F117–E122.7. Marcelletti JF, et al. Calculations for adjusting endogenous biomarker levels during analytical recovery assessments for ligand-biding assay bioanalytical method validation. AAPS J. 2015;17(4):939–47.8. US Food and Drug Administration. Guidance for industry: assay development and validation for immunogenicity testing of therapeutic protein products. Silver Spring: Center for Drug Evaluation and Research; 2019.9. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration, Process validation: general principles and practices. Guidance for industries; 2011.10. Sondag P, et al. In: Zhang L, editor. Nonclinical statistics for pharmaceutical and biotechnology industries. Statistics for Biology and Health. Cham: Springer; 2016.p.415–32.11. Schofield T. Lifecycle approach to bioassay. In: Nonclinical statistics for pharmaceutical and biotechnology industries. Cham: Springer; 2016. p.433–60.12. Scherder T, et al. Continued process verification. In: Statistics for biotechnology process development. Boca Raton: Chapman and Hall/CRC; 2018. p. 265–84.13. Levey S, et al. The use of control charts in the clinical laboratory. Am J Clin Pathol. 1950;20(11):1059–66.14. Montgomery DC. Introduction to statistical quality control. 6th ed. Hoboken: Arizona State University, Wiley; 2009.15. Westgard JO. Interpreting SQC results using “Westgard Rules”. In: Westgard JO, editor. Basic QC practices, vol. 2016. 4th ed. Madison: Westgard QC; 1998. p. 45–58.16. Sullivan LP. Reducing variability: a replacement approach to quality. Qual Prog. 1984.17. Kelly M, et al. Large molecule run acceptance: recommendation for best practices and harmonization from the global bioanalysis consortium harmonization team. AAPS J. 2014;16(2):221–5.18. Parvin CA, et al. C24-A4. Statistical quality control for quantitative measurement procedures: principles and definitions. 4th ed. Wayne: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2016.19. Westgard JO. Statistical quality control procedures. Clin Lab Med. 2013;33(1):111–24.20. Geist B, et al. Monitoring quality of critical reagents used in ligand binding assays with liquid chromatography mass spectrometry. In: Protein analysis using mass spectrometry. Hoboken: Wiley; 2017. p. 107–23.
2021-06-10
关于“2021第三届粤港澳大湾区生物医药创新高峰论坛”延期举行通知尊敬的各位专家及全体参会嘉宾： 鉴于广东省及广州市的疫情防控形势，经大会组委会慎重决定，原定于2021年7月24日在广州举办的“2021第三届粤港澳大湾区生物医药创新高峰论坛”将延期举行，具体举办时间另行通知，欢迎关注！ 本次论坛在各界的鼎力支持下，各项准备工作进展顺利，组委会对会议延期深表遗憾！由此给大家带来不便，深表歉意！ 组委会向对本次论坛组织工作给予巨大支持的各位专家致以崇高的敬意！对积极准备参会的各界来宾以及关心与关注本次论坛的社会各届朋友表示深深的感谢！如有关于本次论坛的任何问题请联系组委会工作人员。 前程千帆景，胸中百万兵！来日再见！后会有期！ 附组委会工作人员及联系方式： 马小姐：15652387362潘小姐：15603052690陈小姐：15766393058
2021-06-25
