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上周，“袁来如此”专栏根据已发表的文献资料，对临床免疫原性的评估作初步介绍（袁来如此 | 蛋白质和多肽药物临床免疫原性的评估和报告（1_上）：基本概念和临床相关性 ）。本期将延续上期内容，重点就确定ADA免疫反应的特征以及ADA临床相关性分析等方面进行探讨。 本期内容是《袁来如此》专栏的最后一期，感谢各位读者对本栏目的关注与支持！未来金沙集团1991入口将继续在相关学术领域深耕，适时推出科普学术专栏，敬请期待！ 确定ADA免疫反应的特征 对临床免疫原性解释的一个基本指标是ADA在该研究中或在可比较的所有同类研究中的发生率。经过验证的ADA测试方法将样品表征为ADA阳性和阴性。此外，当使用易受药物干扰的检测方法时，建议将含有药物干扰的样品划定为第三类—ADA-无结论。早先的文献中最初建议，此类样品应报告为“阴性，但可能有药物干扰”，其目的是想表达：此类样本的ADA状况未确定或测试结果可能不准确。然而，新的生物分析技术和样品预处理步骤（例如，酸分离），经过仔细优化和验证，是能够提供准确结果的，这应该会帮助减少ADA无结论的样品。ADA的生物分析策略和技术细节不在本文讨论的范围之内，但后续"生物分析注意事项"中简短地讨论了可能影响免疫原性结果的方法学问题。 首先，需要根据体外测试方法得出的数据对受试者的ADA状态进行分类，建议根据以下定义对受试者的每个样本进行分类（“样本ADA状态”）： • ADA 阳性样本：当在样本中检测到 ADA ，该样本被视为阳性。 • ADA 阴性样本：当未检测到 ADA 且同一样本中药物不存在或即便存在，但具有已被证明不会干扰ADA检测的水平，则该样本被视为阴性。 • ADA 无结论样本：当未检测到 ADA ，但样本中存在药物，其水平可能干扰 ADA 的检测方法，则不能无可争议地确认该样本为阴性，最好将其归类为 ADA-无结论样本。 • 不可测评样品：样品由于样品量不足、处理不当或样品收集、处理、储存等错误而无法测试 ADA 状态（“未检测的样品”）的样品。 需要对上述定义作出以下澄清：“检测到”意味着药物分子特定的ADA得到确认（confirmed）。此外，测定的“药物耐受性”（不干扰ADA检测方法的最高药物浓度）并不是一个绝对数值，因为每个受试者之间会有所不同（由于ADA引起免疫反应的亲合性不同）。众所周知，人体的免疫反应因受试者而异，并且检测中所使用的阳性对照品的性质也不能外推到临床样本中去。但是，目前实用的方法也只是使用一个或多个ADA阳性对照品来开发检测方法。这样开发的方法能够耐受高于预期最高的血液药物浓度，而不至于受到药物的干扰。 因此，制药厂家可以考虑采取保守的方法，例如将ADA检测方法的药物耐受水平提高到ADA样本中预期药物浓度峰值的两倍。同时，在可行的情况下，在预期血药浓度最低（低谷浓度，trough concentrations）或处于药物“洗净washed out”阶段来采集ADA样品，这样的取样策略可以更准确地检测ADA。值得注意的是，用“边界阳性（borderline positive）”一词来描述具有位于检测切点（assay cut point）上方的阳性结果的样本（经确认存在ADA）是不合适的，这些是阳性样本，其滴度至少等于检测方法所需的最小稀释度（MRD）。 其次，根据样本的ADA状态，建议使用以下定义确定每个受试者的治疗-免疫原性显现的状态（受试者ADA状态）： •可评估受试者：该受试者在治疗或后续观察期间至少获取了一个适合做ADA检测的样本（有可报告结果）。只有可评估受试者会用于计算治疗引起ADA的发生率。建议在适合检测抗体的时间点采集样本，如"采样"部分所述。 •不可评估受试者：在治疗或后续观察期间，服用药物后一个样本也没有采集到（或者没有可报告的结果）的受试者。然而，虽然该受试者被排除在治疗-免疫原性显现的分析之外，但如果基线样本有可报告的结果，则该受试者应纳入预先存在ADA的人数中。另一方面，如果一个不可评估受试者的所有样本都无法评估或没有可报告的结果，那么该受试者就不参与任何免疫原性分析。 •ADA阳性受试者：在治疗或后续观察期间的任何时间取样，至少有一个治疗引起或治疗增强的 ADA 阳性的样本。 •ADA阴性受试者：在治疗或后续观察期间的任何时间取样，没有一个治疗引起或治疗增强的 ADA 阳性的样本。 •ADA无结论受试者：不能无可辩驳地归类为 ADA 阴性的受试者。为此类别建立一个单一的定义是不可行的：因为对于不同类别的产品和不同情况，存在多种可能的原因导致这种状况。因此，在开发生物药时，应将药物的免疫原性风险的概况、先前使用该药物的经验、同类药物的标签信息或相关文献和/或与监管机构的讨论等，全面纳入考虑和评估，以便对ADA无结论受试者定义一个合用（fit-for-purpose）的类别。 例如： a.尽管在受试者使用某个高风险药物治疗期间（包括随访观察期）观察到一些ADA阴性样本，但其他多个样本都属于无结论样本，以致无法对受试者的ADA状态得出明确结论。 b.尽管在受试者使用低风险药物治疗期间（包括随访观察期）的所有样本都是ADA阴性，但最后一个可评估样本是个无结论样本。因此，保守的说法就是这个受试者是ADA无结论受试者。当然，如果不这样判定，就应当提出合理的科学证据。 将对ADA检测呈阴性，但能检测到药物（或其浓度在该方法的药耐限量之上）的样本判定为ADA-无结论样本可能是一个存在争议的问题。普遍持有的观点是：ADA样本检测的结果应“按原样”报告，即仅有阳性或阴性这两种结果，这些结果可根据其它测试（如PK和PD）的结果加以审视；如果对ADA阴性结果的怀疑有进一步的证据（基于其它检测），则需要进一步解释。但是，此方法假定进行其他适当的测试，即它们能够容忍ADA的存在，并且有足够的敏感性和选择性，因而足以证明ADA的效果。 可能出现的另一个有争议的问题是：ADA无结论受试者是否应包括在具有ADA结果（报告为ADA阳性或阴性的比例）的受试者总数（分母）中。 另一种观点认为，ADA无结论受试者不应包括在分母中，因为“药物不耐受”的ADA检测方法会报告假阴性数据。另一方面，如果ADA无结论受试者只占被评估受试者的一小部分，免疫原性风险被认为较低，或因为无法完全地确信所测定的“药物耐受性”（因其不是一个很准确的限度），则包括这些受试者是可以接受的。例如，在某些肿瘤药物研究中，包括 ADA-无结论受试者可能是合理的，这些研究通常使用高剂量的药物（导致药物的血清低谷浓度的水平较高），药物洗净期（washout periods）也常常无法实现。 如果是这样做的话，就应该在药品标签上清楚地解释相关注意事项。无论做何决策，都应该对 ADA 检测方法与其药物容忍限度有良好的理解，使用多个 ADA 阳性对照，使用来自正交的检测方法或技术的支持性数据，与相关医药监管机构进行协商。 最后，值得注意的是，在临床研究设计中，一个重要的考虑因素是建立一个采样策略，即在预期药物浓度最低（低谷浓度）或消除阶段（药物洗出）时采集样本，以增加准确检测到和正确报告 ADA 的可能性。在将受试者及其样本分成上述“ADA状态”的类别之后，建议从不同角度对组合数据集进行详细评估。如果样本大小允许，也应该按每个相关变量，如：剂量、给药频率、给药途径、给药次数、药物暴露天数（每天注射一次或多次药物）、同时用药（特别是免疫调节剂）等等，进行分析。ADA临床相关性分析 评估ADA阳性样本的临床相关性的第一步是以不同的方式将数据可视化。可视分析的程度将取决于药物所处的开发阶段、样本数量和ADA发生率（ADA阳性受试者越多，数据的统计相关性或对“趋势”的判断更可能是有价值的）。因此，数据分析的类型和范围应以合理的科学判断与相关医药监管机构的协商为出发点和动力。一些有价值的ADA 属性分析类型如下: • 预先存在的ADA、滴度和增强（boosting）： -基线ADA阳性受试者占其基线样本的受试者总数（经ADA测试，有可报告的结果）的百分比； -基线ADA阳性样本的滴度范围（中位和四分位数[IQR]范围）； -服用生物药后ADA阳性基线受试者中ADA阳性受试者显著增加的百分比：即在初始给药后，采集到的任何一个样本具有ADA滴度，并且该滴度以科学上合理的幅度，如4倍或9倍，超越基线滴度。 • ADA发生率和滴度： -ADA总体发生率：治疗增强和治疗引起ADA阳性受试者的总和，除以可评估受试者的总数，而得出的百分比。不包括给药后没有任何样本供评估，基线阳性的受试者。 -治疗引起的ADA发生率：治疗引起ADA阳性受试者总数，除以可评估的，基线ADA阴性的受试者总数，而得出的百分比。此外，需要报告此组受试者滴度的峰值和范围（中位数、IQR）。 •中和性ADA：如果适用的话，按上文所述分析报告预先存在的NAb、增强和发生率。如果ADA在所有受试者中都是中和性ADA，则无需作单独的分析。 •ADA动力学：ADA出现的时机及其持续时间对于临床医生监测治疗的进展非常有用。抗体的持续性在几个病例中显示与临床效应相关联。 对药物开发人员而言，关于ADA动力学知识有助于优化同一生物药后续研究中的采样计划，以及作为药物上市后药物警戒计划的一部分，助力ADA监测计划的优化、风险的管理和缓解。 ADA动力学的图像表示是最有用的。例如，图1中说明了ADA开始和ADA持续时间的双变量图；图2中所示为瞬时态与持续性ADA频率图。当ADA阳性受试者数量较多（例如≥20），并且研究持续时间足够长，足以识别其发育后持久性抗体（例如≥1年）时，这些类型的图表蕴含的信息最丰富。 图1.治疗引起的ADA动力学: 发生和持续时间。ADA阳性结果持续时间与ADA发生时间的示意图。垂直和水平网格线绘制在分布的四分位数处：这有助于确定ADA的持续性或瞬时性是否与在患者中观察到ADA的时间相关。为了保证评估的准确性，只有那些ADA始发时间是上次访问前至少16周，或者在上次访问时或之前是ADA阴性的患者，才应列入此图。在解释此示意图时，应牢记在较晚的ADA始发时间的最大持续时间将按比例减少。图中的符号可以指示所选择的变量（本例中是剂量），临床效应，如：对疗效的影响（例如：是，否，和研究中断），不良反应（例如：是，否，和研究中断）等。 当样本量足够大时，还建议对结果进行更多的统计描述。这种客观的方法可以防止由于主观偏见而曲解结果。但值得注意的是，对于样本量大小的评估应根据具体情况判断，也要取决于临床研究的设计。建议采用以下计算方法： （a）ADA的始发（Onset）：指在研究中初次给药到发现第一例治疗引起ADA的时间段。使用实际经过的时间是计算该时间段的理想选择，不过使用最初设定的研究时间段也是可行的。计算“ADA 出现的时间中位值（median time to ADAdevelopment）”和四分位数 Q1 和 Q3，可以分别用来解释50%、25%和75%的ADA阳性受试者的ADA始发时间。分析ADA始发相关的其他参数可以是：“到ADA始发的给药次数"或 "到ADA始发的药物暴露天数”。 （b）ADA的持续时间：指药物引起的ADA的寿命。计算和报告诱导发生的ADA响应的中位持续时间和IQR，对于评估其与临床效果的相关性，是最客观的方法。但粗略地将 ADA 分类为瞬时性与持续性的方法占主导地位。虽然没有必要使用此类术语进行分类，但在应用这些术语时，使用统一定义就变得非常重要了。因为天然（内源性）的人类IgG1，IgG2和IgG4的半衰期大约在21-25天左右，五个半衰期大约等于16周。如果ADA只被药物诱导产生，并且从未被重新刺激或增强（一种"瞬时态"抗体），它将受人体的天然清除机制的约束。因此，ADA预计将在五个半衰期之后被完全清除（实际上只剩下微不足道的3%）。因此，可以用此现象区分瞬时性（血清返还sero-reverting）与持续性ADA，并建议用以下方法来评估ADA的持续时间: • 瞬时性 ADA 响应： –药物治疗引起的ADA在治疗或后续观察期间只在一个采样时间点检测到（不包括最后一个采样时间点，除非在之后被证明无法检测到），否则应视为持续性的，或： –药物治疗引起的ADA在治疗期间（包括随访期，如果有的话）有两个或两个以上采样时间点被检测到，其中第一个和最后一个ADA阳性样本（无论中间有任何阴性样本）是小于16周的时间段间隔，并且受试者在最后一个采样时间点是ADA阴性。 • 持续性 ADA 响应： –药物治疗引起的ADA在治疗期间（包括随访期）有两个或两个以上采样时间点被检测到，其中第一个和最后一个ADA阳性样本（无论中间有任何阴性样本）间隔有16周或更长，或： –药物治疗引起的ADA发生率仅在治疗研究期的最后一个采样时间点，或者与上一个ADA阴性的间隔不到16周的采样时间点。虽然很少见，但如果IgG3或IgA的ADA在研究人群中占主导地位，则应用5周（而不是16周）的时间段来修改瞬时性和持续性ADA的定义。这是因为IgG3和IgA的半衰期比其他IgG短（IgG3为7天，IgM和IgA为5天）。 请注意，治疗增强的ADA被排除在ADA动力学分析之外，因为这种类型的免疫反应在机制上有所不同。在预先存在的ADA非常普遍的情况下，单独描述增强ADA的动力学可能很有用。这时，无需将ADA响应分为瞬时性（transient）和持续性响应。计算ADA的中位持续时间和四分位数（Q1和Q3）后就可以分别描述50%、25%和75%的ADA阳性受试者的ADA持续时间。四分位数方法可以更好地阐明ADA持续时间与临床效应之间的关系（如果有的话）。最后一点，将瞬时性和持续性抗体分别定义为在研究结束前消失和在最后研究时间点仍然存在的抗体，是不太合适的，这是因为瞬时性和持续性ADA的定义将取决于临床研究的长度，而并非ADA实际持续的时间。如果使用这样的定义，较长的临床研究会将ADA的性质偏颇地判断为"瞬时性抗体"。 • NAb 发生率和动力学： 当研究结果表明：受试者可以根据他们是否拥有NAb与non-NAb 而分组时，可以运用上文所述方式，分别详细考察每个组NAb的发生率和动力学。 • 交叉反应性： 当生物药物分子与内源性蛋白（全部或部分）相同或几乎相同时，评估ADA与内源性蛋白的交叉反应性非常重要，因为人们越来越担心这种ADA可能导致以内源性蛋白质耗尽为特征的自身免疫性综合征。将具有交叉反应性的ADA和对药物分子的ADA滴度和动力学进行比较会有助于评估相关疾病的恶化。 图2.治疗引起的ADA发生动力学: 一个研究实例中的瞬时和持续ADA免疫反应的发展。每一点表示在所示发病时间出现ADA的受试者的百分比，其持续时间可能是短暂的或持久的。在此示例中，10%的受试者有 2个月的ADA始发时间，其中4%具有瞬时性ADA响应，6%具有持续性 ADA响应。类似的，在6个月的ADA始发时间，0.5%有瞬态ADA响应，5.5%有持续的ADA响应。该图的横轴也可以使用剂量。 可以使用替代方法描述这些ADA的属性。但是需注意的是，主观性的术语应该避免，因为它们可能被错误地解释为暗示与临床效应某种程度的关联性。例如，ADA阳性人群的滴度可以报告为中位数和四分位数范围（IQR），但不宜使用诸如“高”或“低”等词语，因为人们可能错误地认为高滴度的抗体与临床效应相关（即引起不良事件），而低滴度的抗体则不会（即良性）。 图3.ADA滴度动力学。研究中随时间变化的这种滴度图有助于确定ADA水平在治疗过程中是否随时间而变化。每个框图表示滴度范围、Q1、中位数（Q2）、Q3，不包括异常值（星标）。 ADA数据可以酌情以表格、文本或图像等形式显示。其中，以表格形式提供原始数据可以帮助监管机构能够进行独立的分析，以验证所提交的结果。当在表格中提供样本分析结果时，最好包括：受试者识别号、临床站点识别号（姓名或编号）、计划的随访或给药访问（预定时间点）、给药剂量/频率、样本采集日期（实际时间点）、测定的药物血清浓度、样本ADA的状态和滴度、中和能力状态等。ADA阳性受试者数量很少的研究可能会限制某些数据分析的进行。总结与前瞻 此文为本《蛋白质和多肽药物临床免疫原性的评估和报告》系列的第一篇，包含相关定义和术语、ADA免疫反应的特点以及其临床相关性分析。后续文章将涉及ADA状态与PK/PD，临床安全性和疗效的关系。 特别声明本文如有疏漏和误读相关指南和数据的地方，请读者评论和指正。所有引用的原始信息和资料均来自已经发表学术期刊、官方网络报道等公开渠道，不涉及任何保密信息。参考文献的选择考虑到多样化但也不可能完备。欢迎读者提供有价值的文献及其评估。 参 考 文 献 1. 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本期《袁来如此》为系列文章《蛋白质和多肽药物临床免疫原性的评估和报告》的第一篇，旨在根据已发表的文献资料，对临床免疫原性的评估作初步介绍，包含相关定义和术语、ADA免疫反应的特点及其临床相关性分析。 由于内容篇幅较长，本文将采取上下篇形式进行推送，《袁来如此》系广州金沙集团1991入口微信公众号打造的科普学术专栏，敬请垂注！ 评估生物药的免疫原性是开发生物药过程中的一个重大关注点，因为它会影响生物药的安全性和有效性。迄今为止，文献中对药品免疫原性的描述各不相同，这一方面是因为学者们对药品免疫原性的理解程度随时间在不断加深，另一方面要归结为该领域专业词汇不断演变造成了一定的混乱。庆幸的是，随着近年来业界对于评估药品免疫原性所需的数据日益达成了共识，相对统一的表述也逐步形成。 描述抗药物抗体（ADA）的发生率、动力学和强度、中和能力、与内源性分子或其他上市生物药的交叉反应以及相关的临床影响，可加强对使用这些生物药的患者的护理。为此，需要对描述和分析临床免疫原性数据的术语和定义、呈现数据的方法、ADA的出现/发展与药代动力学、疗效和安全性的关联等评估免疫原性的临床相关性所必需的工具做一个梳理。导论 蛋白质药物（也称为生物制剂、生物药或生物制品）和多肽具有诱发免疫原性的潜力，本文中称此类别的药物为“生物药”。在传统意义上，多肽虽然不被认为是生物制剂或蛋白质药物，但仍可能具有类似于蛋白质的免疫原性。美国和欧洲监管机构目前将多肽区分为重组（生物）实体与合成（化学）实体，要求分别提交不同的生物制剂许可证申请（BLA）/营销授权申请（MAA）。 具有免疫原性的药物能造成的临床后果各不相同，没有任何临床效果或者严重、危及生命的反应都有可能发生。抗药物抗体（ADA）可引起输液反应（infusion reactions）、过敏反应（anaphylaxis）以及免疫复合物（immune complex）介导的疾病，ADA还导致次级治疗失败（即疗效的损失），在极少数情况下，还可能引起更严重的不良事件，如缺乏综合征（deficiency syndromes），例如血小板减少症（thrombocytopenia）和纯红细胞发育不全（pure red cell aplasia）。因此，ADA是一个涉及生物药的安全性和长期疗效的医学难题，在临床研究期间评估患者ADA的出现和发展十分关键，而且并不能单纯只是以临床症状为关注点，需要密切关注和评估ADA的产生和发展的机制性问题。因此，阐明ADA响应及其临床特点与其造成的相关后果，借以指导医疗实践，是至关重要的。 近年来行业界已经开发出各种方法来降低蛋白分子的免疫原性，包括使用全人类蛋白质序列、修改已知或预期的免疫原显性表位、使用哺乳动物细胞系统生产药物、实施先进的生产方法和分析表征技术。但是，人类免疫系统仍然可以感知来自生物药的“异质性/非自我性”或“危险信号/自身压力”等因素，从而对生物药产生特定的免疫反应。 事实上，大多数已批准上市的生物药物都是免疫原，ADA的发生率可以达到90%以上。更重要的是，ADA及其临床后遗症的发生率在同类产品之间以及患者群体之间可能有很大差异，这妨碍了对免疫原性的预测。所以，我们必须在临床研究时加以监测。这种差异可能是由于使用不同的生物分析方法、数据解释方法，以及大量产品特异和患者特异等因素所造成的。而使这一问题更加复杂的是，用于收集、分析和呈现免疫原性结果的术语和方法缺乏一致性和标准化。 生物药标签或处方会在不同程度上描述临床免疫原性，但往往只提到在关键的临床Ⅲ期研究中ADA和中和性抗体（NAb）的总体发生率。这些有限的信息并不足以真正告知医生和患者在临床实践中使用该药物的真正收益与风险，对ADA相关事件缺乏充分和一致的描述可能导致临床医生错误地管理患者的用药。 为了给患者提供最佳的治疗计划，有关免疫原性的具体信息可在如下情况下让医生受益：在启动治疗方案时的安全性考量，在可接受的安全性前提下如何维持治疗效果，以及提供在患者中出现ADA时如何应对的选项。示例包括：在初次给药或间歇性重新给药时出现过敏反应的风险；在存在ADA的情况下，以实现治疗效果为目标的给药策略，以及在何种情况下需要停止治疗，或者评估切换到其他同类产品或具有不同作用机制的产品的后果。因此，产品标签需要描述ADA的发生率、程度、始发时间、持续时间、中和能力、与内源性分子或其他上市生物药的交叉反应，以及其临床相关阈值，以便在临床上优化使用该生物药治病的疗程。 因此，本文将探讨与生物药的免疫原性相关的，常用于产品免疫原性描述的术语和定义，数据分析和呈现方法，以及临床医生评估免疫原性的临床相关性的指南，并且对临床研究中评估ADA时所用的采样模式以及相应结果的解释和呈现提出了具体建议。由于药物开发阶段或药物警戒目标以及对特定风险的具体评估不同，相关数据的分析和解释也会有所不同，因此，上述建议将作为一般方法加以推荐，以增进对免疫原性的理解，但这并非意味着能够以其取代当前的监管指导文件、与卫生机构协商的结果、合理的科学判断。定义和术语 在免疫原性研究中的常见定义或术语汇集如下： •生物药：此术语指使用生物技术生产出的治疗性蛋白药物，包括单克隆抗体（mAbs）和多肽、一些血浆衍生产品（例如，凝固因子替代产品）和使用天然方法生产的蛋白质（例如，治疗性酶和毒素），但不包括：寡核苷酸、细胞产品和疫苗。生物药包括多肽，无论是用何种方法，化学合成的或生物系统表达生产的，也无论目前监管机构对生物药是如何定义的。 •抗药物抗体（Anti-Drug Antibody，ADA）：能与生物药反应，结合的抗体，包括用药前存在的宿主抗体（能与目前使用的生物药发生交叉反应的宿主抗体，称为“基线ADA”）。它包括中和性的和非中性的ADA。等同于ADA的其他术语包括：抗治疗抗体（Anti-Therapeutic Antibody，ATA），抗产物抗体（Anti-Product Antibody，APA），或抗生物抗体（Anti-Biologic Antibody，ABA）。 •药物结合抗体（Binding ADA）：所有ADA本质上都是“结合”抗体。因为，它们都经体外测试的方法确定与生物药分子结合。这个定义不涉及其在人体体内活性的相关性，即这种结合是否产生临床效应。通常，滥用此术语的情况是仅将其应用于非中和性抗体，而事实上，中和性抗体也属于药物结合抗体这一大类别。 •中和性ADA（NAb，Neutralizing ADA）：通过体外试验或动物生物学方法确定的，能够抑制或减少生物药分子药理活性的ADA，无论其人体临床的相关性如何，即无论测试结果与受试者上的临床效应是否有关。 •非中和性ADA（non-neutralizingantibody，non-NAb）：ADA与生物药分子结合，但不抑制其药理活性（经体外测试或基于动物的生物学方法测定），无论其人体临床的相关性如何，即无论测试结果与受试者上的临床效应是否有关。 •药物维持性ADA响应：能降低生物药体内清除率的ADA免疫响应，该生药物的半衰期在其与此ADA结合的状态比在其未结合的状态要更长（通过统计学方法判断的）。与ADA结合后的药物可能有药理活性（与非中和性ADA，即non-NAb结合时），也可能没有药理活性（与中和性ADA，即NAb结合时）。 •药物清除性ADA响应：能增加药物体内清除率的ADA（NAb或non-NAb）免疫响应（通过统计方法判断），这里是ADA免疫响应（不是ADA本身）被视为“清除性”的。这个和上一个定义描述了ADA对生物药分子造成的某种后果，即该生物药体内清除率的变化。ADA对药物清除率的影响涉及多层面的机制：循环中免疫复合物晶格（circulating immune complex lattice），补体结合，Fc受体结合等。一般来说，除了药物的正常清除途径外，ADA与生物药分子形成的免疫复合物是由reticuloendothelial system清除的。由于免疫复合物的大小取决于抗原和抗体的浓度，在某些情况下，ADA可能只在超过一定滴度阈值的情况下才会增加药物体内清除率。 •人抗鼠抗体（Human Anti-Murine Antibody，HAMA）：对存在于鼠源或人源化的mAb药物分子上的鼠原表位的人类抗体。从字面上看，这个术语可以解释为：对某个mAb药物产生的ADA可能与其他含鼠序的抗体发生交叉反应。将含有鼠序的mAb药物给予ADA阳性的患者可能会是一个问题。当未确认ADA与其他鼠源抗体有交叉反应时，建议避免用HAMA代表对鼠源抗体药物的ADA。 •人抗嵌合体抗体（Human Anti-Chimeric Antibody，HACA）：人类对存在于嵌合体mAb药物分子中非人类表位（通常是：人+另一物种，通常是小鼠）产生的抗体。从字面上看，这个术语可以解释为ADA可能与其他嵌合体抗体发生交叉反应，给ADA阳性受试者服用其他嵌合物抗体药物可能会是一个问题。当未确认ADA与其他嵌合体抗体发生交叉反应时，建议避免使用HACA代表对嵌合体mAb药物的ADA。 •人抗人抗体（HAHA）：对存在于人源化的或完全人类的mAb药物分子中的人/人源化的表位产生的ADA。从字面上看，这个术语可以解释为该ADA可能与其他基于人类序列的抗体发生交叉反应。因此，给ADA阳性的受试者服用其他人类mAb药物可能会是一个问题。当未确认ADA与其他基于人类序列的抗体发生交叉反应时，建议避免使用HAHA代表对人源或人mAb药物的ADA。 •风湿因子（RF）：一种内源性免疫球蛋白，通常结合IgG的Fc部分。RF通常存在于患有自身免疫性疾病（如类风湿性关节炎）患者的血清中。风湿因子有时也会出现在其他疾病患者，甚至健康个人的血清中，并可能干扰ADA检测方法。 •预先存在的ADA：指在治疗前（或临床研究开始之前），受试者体内存在的与生物药反应的抗体。此术语与“基线ADA”类似，严格地用于代表治疗开始前检测到的与药物反应的抗体，而不论这种反应的起因（即无论患者是否在过去接受同一药物，或因接触其他药物/抗原后，所产生的能交叉反应的抗体）。 •治疗引起的ADA：在服用生物药之后产生的新ADA（血清转化），即在没有预先存在的ADA的受试者中，在最初服用药物后的任何时间内形成的ADA。 •治疗增强的ADA：预先存在的ADA，在服用生物药后被提升到更高水平。即在初始服用药物后的任何时间内，ADA的滴度以科学合理的倍数（如4倍或9倍）超出基线滴度。 •ADA流行率（prevalence:）：所有在任何时间点具有药物反应抗体（包括预先存在的抗体）的受试者与可以评估的人群的比值。此术语与 ADA 发生率不同（见下文）。 •ADA发生率（incidence）：在研究期间发现有血清转化或增强其先前存在的ADA的研究人群的比例。是“治疗-出现ADA”的同义词，ADA发生率为治疗引起的和因治疗增强了的ADA阳性受试者的总和与可以评估的人群的比值。术语“ADA比率（rate）”不应用于代表ADA发生率，因为“rate”通常意味着一个测量单位随时间的变化，而"发生率"是测量单位与相关单位总群体的比值。此术语与 ADA 流行率不同（见上文）。 •滴度（titer）：样本中ADA水平的准定量表达。通过采用基于连续倍比稀释的测试方法，滴度被定义为样品（包括MRD，最低稀释度）产生阳性结果（即高于预定的“切点”值的结果）的最高稀释倍数的倒数，例如，稀释1/100=滴度为100。滴度也可以在用对数转换后呈现。或者在切点值处，通过从稀释曲线插入值，来推导滴度。临床免疫原性的分析与报告 与预定的临床研究策略（如：在关键临床研究中设定的剂量）相关的综合性的免疫原性分析策略和计划对于阐明免疫原性数据的临床相关性至关重要。 应当使用灵敏和验证过的分析方法对ADA进行测试，并采用适当的策略来阐明免疫原性。在检测到ADA之后，特别是在后期临床研究中，需要评估ADA反应的强度（滴度）与其体外的中和能力。ADA的其他特征，如免疫球蛋白亚型（subclass）或等型（isotype）的测定、域映射（domain-mapping）、相对结合亲和力、与内源性蛋白质的交叉反应性或ADA的补体激活能力，也可能需要评估，但这往往取决于对特定产品、特定临床适应症或某些基于风险评估的需要。 还可以根据动力学特性进一步描述ADA的属性，即药物暴露后，什么时候这些抗体最早出现（ADA的发生，onset）以及持续多长时间（ADA的持续时间，duration）。ADA的任何上述属性和动力学特征都可能与其临床效果相关。因此，临床研究的ADA结果可以表述为：（a）ADA免疫反应的特征；（b）ADA与药代动力学（PK）的关系，以及药效动力学（PD）生物标志物的关系；（c）ADA与所测试药物的临床安全性和有效性的关系。 ADA的临床后果可能从没有明显临床效果到疗效缺失（初级治疗失败）、疗效损失（次级治疗失败）或因生物药物暴露量改变而药效增强、药物不良反应（与给药有关的全身或部位反应），以及严重的药物不良反应（过敏和与内源性分子的交叉反应和中和相关的独特的临床问题）。因此，详细考察ADA或其属性与各种临床后遗症之间的任何关联就变得非常重要。 一方面，清除性ADA的免疫反应（对PK的影响明显）和非清除但是中和性的ADA响应（如低滴度的NAb对PD的明显影响）可能会对临床疗效产生负面影响，但另一方面，ADA的存在并不一定排除ADA阳性患者使用该药物，因为临床药效最终取决于ADA对PK和PD的影响程度。因此，ADA与PK/PD的关系是一个重要的附加考虑因素，但并不一定就会导致临床上的不良后果。 特别声明 本文如有疏漏和误读相关指南和数据的地方，请读者评论和指正。所有引用的原始信息和资料均来自已经发表学术期刊、官方网络报道等公开渠道，不涉及任何保密信息。参考文献的选择考虑到多样化但也不可能完备。欢迎读者提供有价值的文献及其评估。 参 考 文 献1. 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今天下午（9月3日），CDE官网连发4份文件，涉及化学创新药早期临床研究、患者报告结局在药物临床研究中应用、药物临床试验数据管理与统计、新冠肺炎新药研发等多个领域。 化药创新药方面，CDE发布《化学药创新药临床单次和多次给药剂量递增药代动力学研究技术指导原则（征求意见稿）》，该文件共涵盖前言、总体考虑、研究设计、数据分析、研究报告等5个方面，征求意见时间为1个月。文件合集 在患者报告结局在药物临床研究中应用领域，CDE发布了《患者报告结局在药物临床研究中应用的指导原则（征求意见稿）》，该文件共涉及引言，患者报告结局定义，患者报告结局测量量表的研发、翻译、改进，患者报告结局测量量表的选择与评价，临床研究中使用患者报告结局的考虑，电子化患者报告结局，与审批机构沟通交流等7个方面，征求意见时间为1个月。文件合集 在药物临床试验数据管理与统计方面，CDE发布了《药物临床试验数据管理与统计分析计划指导原则（征求意见稿）》，该文件共有前言、数据管理计划、统计分析计划、参考文献4个部分组成，征求意见时间为1个月。文件合集 在新冠肺炎新药研发方面，CDE出台了《新型冠状病毒肺炎抗病毒治疗及预防新药临床试验技术指导原则（试行）》（征求意见稿）。该文件共涵盖了概述、早期临床试验、探索性临床试验、确证性临床试验等4个部分，征求意见时间为1个月。 文件合集关于金沙集团1991入口 临床研究服务： 金沙集团1991入口拥有一支规模庞大、专业成熟的临床研究队伍，可提供包括医学、项目管理、监查、稽查、数据管理和统计分析、生物样本检测在内的临床试验全流程解决方案。截至2020年，金沙集团1991入口服务的客户超1000家，完成800多项临床试验项目，助力客户获得新药证书60多项、生产批件超过80项。拥有丰富的临床试验服务经验，服务项目涵盖临床研究各个领域，在肿瘤、肝病、消化等创新药领域拥有独特的临床服务体系。 金沙集团1991入口在全国设有40多个临床监查网点，与全国近600个临床试验机构展开合作，并运用ORACLE OC/RDC及CTMS系统，控制临床数据采集的及时性、管理临床试验过程的规范性。

​此前，“袁来如此”专栏根据已发表的文献资料，对PK定量方法的设计作初步介绍（袁来如此 | 大分子生物分析概论（十四_上）：LBA定量分析双特异性生物药的挑战）。本期将延续上期内容，重点就相关案例分析、复杂药物分子的未来生物分析技术以及前景等方面进行探讨。 “袁来如此”专栏系广州金沙集团1991入口微信公众号打造的科普学术专栏，内容均为金沙集团1991入口药物研究中心资深科学顾问袁智博士原创。 案例分析（Case studies） 以下案例研究是为了说明对于双特异性分子而言，生物分析的独特考虑，其适用于在药物开发的不同阶段设计和实施定量生物分析和PK评估。案例分析1：在非临床研究中定量总和完整双特异性药物并评估ADA对PK的影响。 化合物X是一种基于支架的针对两种细胞因子的双特异性抗体。初步数据表明，这种特殊的支架产品平台可以在非临床物种中高频率地诱导免疫原性。为了更好地解释ADAs存在时的毒理学发现，生物分析小组决定开发两种不同的PK方法来测定动物血清中的总药物和完整药物的浓度。总PK方法是使用两种抗体对支架的框架进行分析。完整的PK方法是使用一种靶向细胞因子作为捕获试剂，另一种作为检测试剂。可以观察到，使用两种PK方法分析相同的样品产生的浓度与时间关系几乎完全等同，除了在较晚的时间点之外，药物浓度非常低的时候，即完整药物浓度略低于总药物浓度的时候。 在这些时间点观察到的低浓度差异只发生在少数受试者上。因此，ADA和生物转化（biotransformation）被认为是最可能的根本原因。需进行一项研究以确定这种差异的根本原因，如生物转化诱导的不稳定性，靶标干扰（target interference）和ADA干扰。为了验证这种双特异性分子的体内生物转化，例如，蛋白质水解是否揭示了影响稳定性的结构缺陷，故开发了两种配体结合质谱(ligand-binding mass spectrometry，LBMS)方法，使用抗人Fc免疫亲和捕获和靶目标捕获，然后进行分层次的质谱分析。采用与ESI-MS相结合的纳米级液相色谱法对非多种代谢产物进行了更高分辨率的分离和鉴定。 数据显示，生物转化的结果为阴性。ADA分析表明双特异性分子比其母体药物的ADA出现频率更高。尽管随后通过免疫原性表征，证实大多数ADAs并非中和性ADAs，但发现ADAs有助于快速地清除完整药物。这些数据也可以解释为当药物浓度足够低时，内源性细胞因子占据了特定的捕获/检测位点，即存在靶标干扰。结果表明，该药物在体内结构稳定。PK数据差异与完整药物的不稳定性无关，而更可能是由于ADAs高水平导致清除药物的速度更快。案例分析2：一个F(ab’)2在体内生物转化为两个活性F(ab)单体的PK分析。 本案例研究涉及一个双特异性F(ab’)2，由一个anti-VEGF arm和一个anti-Ang2 arm组成，用于玻璃体内注射（intravitreal administration）治疗视网膜变性疾病，如湿性老年性黄斑变性和糖尿病性黄斑水肿。据报道，针对F(ab’)2抗体铰链区的，先前存在的内源性抗体(PEA)存在于很大比例的人群中。在未接受药物的食蟹猴和人血清样本中，都证实了这一点。移除这些预先存在的内源性抗体的铰链表位（hinge epitopes）使得该分子中只有单个二硫键将两个fab结合在一起。 因此，注射入玻璃体（其含有glutathione作为抗氧化产品的一部分，以保证晶状体的完整性）后，药物分子生物转化为individual Fabs，相关清除率(t1/2 <1天)，通常比兔玻璃体的Fab (t1/2 约3天)或F(ab’)2 (t1/2 约3天)的清除率要大(未发表的观察结果)。 备注：一般情况下，t1/2与清除率的关系如下，即半衰期还取决于药物分布体积；如果假设分布体积恒定，则t1/2与清除率之间的关系是确定成反比的： 因此，完整的F(ab’)2和individual Fab碎片均存在于眼腔(玻璃体和水相之中)和系统循环之中。正如所预料的，啮齿类动物脉络膜新生血管模型（rodent choroidal neovascularization models）显示，individual Fabs保留了生物活性。为了全面地描述活性药物暴露量的特征，有必要定量这3种药物形式。因此，开发并验证了3种单独的PK定量方法。此前有学者曾经考虑过使用一种总PK定量方法来测定所有这3种形式。但是，该分子是一个新颖结构，故有必要阐明其生物转化的动力学，这对于描述该分子体内的行为是很重要的。 定量完整待测物的ELISA方法使用固定的（immobilized）重组蛋白Ang2捕获待测物，然后加入biotin-VEGF，最后加入streptavidin-HRP，是一个sequential sandwich格式。外加待测物的回收率实验证明这种测试格式仅能够特异性地检测F(ab’)2，但检测不到两种Fab分子中的任何一个。定量两个Fab分子的方法都采纳类似的基本格式：使用各自的靶标-Ang2或靶标-VEGF，从样本中捕获Fabs。然后加入biotin-sheep antihuman IgG的重链和轻链(H&L)，最后，加入streptavidin-HRP进行检测。 值得注意的是，采用测定Fab的格式，也可以检测到完整分子。尽管使用Fabs作为标准品（standards）和对照品（controls），在分析Fab时，也定量了完整F(ab’)2。此外，使用F(ab’)2和任何一个Fab的混合物，可以通过从完整分子（高特异性）的定量结果中减去Fab结果来定量另一个Fab。已经验证了所有这些分析方法，并用于兔血清样本的非临床研究，也认证了这些方法可用于食蟹猴的血清和水/玻璃体/视网膜的萃取物中药物的定量。血清定量分析的另一个挑战是几个ng/ml甚至更低的药物浓度，这也是玻璃体腔生物药给药的一致特点：给药量很小(通常是<1 mg/eye)；药物在到达系统循环时，经历了高倍数的稀释。案例分析3：在非临床研究中监测体内双特异性药物生物转化的总和活性（total and active）药物的定量。 一个针对肿瘤适应症的双特异性单克隆抗体靶向两个细胞表面的抗原，其药理作用取决于单克隆抗体的两个结合臂（both binding arms）的完整。然而，在体外生物物理表征过程中，在其中一个结合臂中发现了翻译后修饰(post-translational modification，PTM)的问题。但这种PTM，不能在不显著损害生物活性的情况下，通过蛋白质工程而排除，因为在不稳定的氨基酸上的点突变（point mutation）会完全破坏单抗与靶标的结合。此外，仅具有第二个结合臂功能的药物变异体的累积，可能会屏蔽活性药物结合第二个靶点，并可能在多次给药后诱发毒性反应。 对该单抗体内生物转化的特征进行研究是势在必行的，如转化的动力学和程度，这可以为进一步开发该单抗提供指导。随后，使用与分子的Fc部分特异性结合的测试试剂开发了一个桥接格式的总药物PK定量方法，辅之以一种活性药物PK定量方法：即使用靶标蛋白作为PTM-liable functional domain的捕获试剂，使用抗人Fc试剂作为检测试剂。利用野生型和拥有点突变的药物的混合比例，活性PK方法，在总药物存在的情况下，能够区分和准确测定活性药物的百分比。之后，评估了该药物分子在食蟹猴上的PK特性。使用了总和活性PK定量方法来测定研究样本中总和活性药物的浓度。实验数据证实，体内样品中的药物出现了PTM，并且活性药物浓度百分比随时间而降低。基于建模和仿真，可以在临床研究中减少剂量间隔来减轻活性药物浓度的降低。非临床研究结果有助于决定使用活性PK定量方法作为支持临床研究的主要方法。而在FIH研究中，总PK定量方法可用于进一步描述无活性药物变异体（inactive drug variants）潜在的累积及其对PK/PD和毒性的影响。复杂药物分子的未来生物分析技术 如表1中所总结的，一般需要多种PK定量方法和ADA方法评估ADC和双特异性抗体的基础药代动力学和免疫原性。分析方法数量的增加给样本的收集、储存、运输、分析和分析方法的生命周期管理带来了巨大的负担。在某些情况下，由于样本数量有限，根本不可能进行多次分析。对于增加的功能域和潜在的生物转化，仅仅增加分析方法的数量以满足生物分析需求似乎是一个直接的解决方案，但“两点式two-point”结合方法（如夹心式LBA）并不适合评估具有多域（>3）构造的分子“完整性intactness”。尽管免疫捕获（IC-）-LC-MS/MS方法在理论上可以识别来自多个功能域的特征肽，但有关“完整性”和功能的信息仍然缺失。因此，随着复杂药物模式（complex drug modalities）的生物转化越来越受到的关注，定量LBA方法和（IC-）LC-MS/MS方法往往无法对潜在的生物转化提供相关信息。正如CovX-Body和基于框架（scaffold-based）的双特异性抗体的案例所表明的那样，PK行为的意外不一致触发了潜在生物转化的嫌疑，进而就需要新的分析方法来进一步研究。表1.ADC和双特异性抗体的PK定量方法（SCR，标准曲线范围；ECL，电化学发光；N.A.，不适用）备注：表格中参考文献的标注不适用。 因此，使用multiplexed PK/ADA方法以测定完整药物、各种变构体（variants）和相关的ADA是非常需要的，同时，也对潜在的生物转化提供相关信息。Multiplexed检测方法已在联合疗法中有早期应用，但尚未看到对复杂药物模式“biotransformation ready”的multiplexed测试方法，用以帮助评估复杂药物的完整性，表征各种生物转化，并测试对药物/药物变构体各部分的免疫反应。下文将简单介绍对复杂药物模式有希望的两项生物分析技术：HR-MS定量分析完整蛋白质和毛细管Western Blot定量分析。HR-MS 定量分析完整蛋白质 与针对完整药物分子中某个选定区域的LBA和LC-MS/MS技术相比，完整蛋白质的定量分析旨在将一个复杂的药物分子作为一个整体来研究，这能够揭示重要的高层次结构和生物转化的相关信息。完整蛋白的LC-MS分析通常用作对生物转化研究的定性分析。Murphy等人使用IC-LC Q-ToF MS，在CovX-Body双特异性抗体上发现并鉴别了蛋白酶剪切掉的含有8个氨基酸的肽段。He等人利用高分辨率的QTOF-MS与IC-LC相结合，成功地在小鼠血浆中，鉴别了若干不同DARs的ADC和生物转化了的变异体（biotransformed variants，由于增加/删除了hexose, glutathione, cysteine以及linker-drug）。近年来，HR-MS在灵敏度和质量分辨率方面的提高，逐渐使其在定量生物分析中得以有更广泛的应用。 Jian等人建立了IC-LC-QTOF-MS的工作流程，用于小鼠血浆中人类mAbs的绝对定量。定量的下限（LLOQ）为1000ng/mL（20 L血浆样品），并可降至250ng/mL，如果使用200L样品。在优化其数据处理策略后，LLOQ降至50ng/mL。使用所述工作流程，Jian等人随后展示了GLP1-Fc融合蛋白的定量；同时，在对小鼠的研究过程中，识别了该药物的两种主要蛋白酶降解产物。 Lanshoeft等人验证了基于multiplex IC-LC-HRMS的PK定量方法，并用于非临床PK研究，该方法同时定量分析了大鼠血清中两个人类IgG1。类似地，Jin等人在大鼠血清中定量了完整的trastuzumab emtansine（一种ADC）及其主要的DAR物种，其定量下限值约为20ng/mL，线性动态范围为5-100g/mL。 另一个有趣的应用是最近Zhang等人报道的，在非变性LC条件下对native intact mAb进行的定量分析，这可能为使用LC-HR-MS技术以multiplex的方式建立结合（bound）/未结合（unbound）PK定量方法以及其它各种功能域PK的定量方法提供了机会。毛细管Western Blot定量分析方法 毛细管Western blot，也称为毛细管纳米免疫测定（capillary nanoimmunoassay，CNIA），已由制造商Protein Simple(San Jose, CA)商业化的Simple Western system，是指毛细管电泳免疫测定系统，它提供基于蛋白质大小和电荷的分离格式。与在分离和检测之前进行配体结合的IC-LC-MS技术不同，Western blot首先分离蛋白质，然后使用配体结合作为检测方法。因此，它能够使用multiplexed immunoassay，同时检测完整的蛋白质及其生物转化的产物，并对变异的各种功能域进行表征。 目前，毛细管Western Blot定量分析在蛋白质药物的PK研究中应用仍然有限。Li等人在小鼠研究中验证了无浓缩的PK方法，以定量小鼠血浆中的polyhistidine N-和FLAG C-terminally-tagged重组蛋白（约55kDa），其LLOQ为20ng/mL。Anti-FLAG tag抗体在immunoblot步骤中用作初级抗体。研究发现，只需以1:100至1:500的比例稀释样品，即可消除基质中高丰度蛋白的干扰。 此外，Kodani等人使用capillary western blot检测到丙型肝炎病毒（HCV）的IgG抗体，表明其在抗药物抗体（ADA）检测方面的潜在应用。重组HCV蛋白首先在毛细管中分离和固定。稀释的人类血清随后在毛细管中孵育，使抗HCV抗体与固定的抗原结合。这一步骤之后，使用抗人类IgG-HRP抗体再进行第二次孵育。在70个特表征良好的人血清样本的检测中，该方法与另一种市售的抗HCV抗体测试方法的相关性良好。结论 为了解决双特异性分子开发过程中所需的生物分析支持，本文讨论了在开发这些药物分子的PK分析策略时一些独特的考虑。本文提出的策略和方法可以应用于双特异性分子和其它多域大分子药物，这需要对特定的药物分子其作用机制（MOA）和潜在的靶标生物学，以及评估PK/PD的所需要的数据有全面的了解。 大分子生物分析行业需要新的定量分析技术来开发multiplexed PK定量方法，以便定量复杂模式的药物及其生物转化产物。用于完整蛋白质分析的（IC-）LC-HR-MS和capillary Western blot技术拥有很大应用前景，因其multiplexibility和提供目标待测物的多维信息（如分子量等电点和域功能/domain functionality）的能力。在过去几年中， HR-MS和capillary Western blot platforms的定量灵敏度有了显著改善，尽管这些技术仍需要进一步改善，以获得更广泛的接受。当前HR-MS系统的一般操作相对简单，但HR-MS（以及capillary Western blot）的数据分析、解释和验证，从监管的角度看，还需要进一步明确。 从理想的和雄心勃勃的角度思考，最好将PK/PD/免疫原性/生物转化的生物分析整合到一个分析测试方法之中，以减少药物开发所需的资源，并促进在同一组患者样本中全面阐明药物的PK/PD行为。设计和开发这样的定量分析的方法，对每一种生物药结构都是独特的，需要一种彻底的“适合其用途”的方法及其确认（confirmation）。为双（多）特异性分子开发可靠、稳健和可重现的PK分析方法是非常具有挑战性的，因为多种因素会影响准确（accurate）而有意义（meaningful）的浓度测定值。未来生物分析行业和监管机构对指导定量分析这些高度复杂的生物（蛋白）药的最佳做法的讨论和意见，将会极具价值。未来前景 随着生物分析方法的特异性、选择性和灵敏度的不断提高，更准确（accurate）和更精密（precise）的测定双特异性抗体浓度和评估其在生物样品中的免疫原性将成为可能。预计双特异性和多特异性生物药的数量和种类将继续扩大，这将促进新的生物分析方法的开发，以适应这些分子的结构复杂性和MOAs。 当然，目前的方法将被用于新的蛋白药物的定量。尽管LBA方法是目前生物分析方法的首要选择，并且在可以预见的未来仍将如此，LC-MS/MS方法，由于其与生俱来的multiplexed的定量分析能力，可能会得到更加广泛地应用，以支持双特异性生物药的PK评估。LC-MS/MS比LBA分析具有更少的分析变异性（variability）和关键试剂的可及性（availability）问题。预期分析实验室的自动化将扩展到生物分析的所有阶段，以减少人工错误和提高数据质量。特别声明 本文如有疏漏和误读相关指南和数据的地方，请读者评论和指正。所有引用的原始信息和资料均来自已经发表学术期刊、官方网络报道等公开渠道, 不涉及任何保密信息。参考文献的选择考虑到多样化但也不可能完备。欢迎读者提供有价值的文献及其评估。 参 考 文 献1.Zhu, L, et al. 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